Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
По 0,2 мл каждой из этих инкубированных смесей переносят в новые пробирки и добавляют по 1,10 мл буферного раствора желатина и барбитала и по 0,2 мл разбавленного комплемента морских свинок (например, в разведении 1:150). Эти операции выполняют дважды.
В качестве контрольного образца негемолизированных клеток готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл буферного раствора желатина и барбитала и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.
В качестве полностью гемолизированного контрольного образца готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл воды R и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.
Все пробирки инкубируют при 370С в течение 60 минут и центрифугируют 5 минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) супернатантов при 541 нм и вычисляют для каждой из пробирок степень гемолиза, в процентах, по формуле:
A - A
A----1 х 100,
Ab - A
где :
Аа - оптическая плотность в пробирках с разведениями гемолизина,
Аь - средняя оптическая плотность в трех пробирках с полным гемолизом,
А1 - средняя оптическая плотность в трех пробирках без гемолиза.
На миллиметровой бумаге строят график зависимости степени гемолиза в процентах (по оси ординат) от обратного значения соответствующего разведения гемолизина (по оси абсцисс). Определяют из графика оптимальное разведение гемолизина. Выбирают разведение таким образом, чтобы дальнейшее увеличение количества гемолизина не приводило бы к существенному изменению степени гемолиза. Это разведение принимают за одну минимальную гемолитическую единицу (1 МГЕ) в 1,0 мл. Оптимальное гемолитическое разведение гемолизина для приготовления сенсибилизированных эритроцитов овцы составляет 2 МГЕ/мл.
Результат титрования гемолизина считают достоверным при условии, что максимальная степень гемолиза составляет от 50 до 70%. Если максимальная степень гемолиза не находится в этих пределах, титрование повторяют с использованием более или менее разбавленного раствора комплемента.
Приготовление оптимизированных сенсибилизированных эритроцитов (гемолитической системы).
Готовят подходящий объем разбавленного гемолизина с содержанием 2 МГЕ/мл и равный объем стандартизированной 5% суспензии эритроцитов овцы. Добавляют разведение гемолизина к стандартизированной суспензии клеток и перемешивают. Инкубируют при 370С в течение 15 минут, после чего хранят при температуре от 20С до 80С и используют в течение 6 часов.
Титрование комплемента
Готовят подходящее разведение комплемента (например, 1:250) с использованием буферного раствора желатина и барбитала и выполняют титрование в
двух повторностях в соответствии с Таблицей 2.6.17.-2.
______________________________________________________________________Таблица 2.6.17.-2.
Номер пробирки Объем разведения компле Объем буферного раство
мента (например, 1:250), в мл ра желатина и барбитала, в
мл
1 0,1 1,2
2 0,2 1,1
3 0,3 1,0
4 0,4 0,9
5 0,5 0,8
6 0,6 0,7
7 0,7 0,6
8 0,8 0,5
9 0,9 0,4
10 1,0 0,3
11 1,1 0,2
12 1,2 0,1
Три пробирки в 1,3
качестве контро
ля - гемолиз 0%
Три пробирки со - 1,3 мл воды
100% гемолизом
К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов овцы, хорошо перемешивают и инкубируют при 370С в течение 60 минут. Пробирки охлаждают на ледяной бане и центрифугируют 5 минут при 1000 д. Измеряют оптическую плотность супернатанта при 541 нм и вычисляют степень гемолиза (Y) по формуле:
Ac - Ax
Ab - Ai ,
где
Ас
Аь
А1
оптическая плотность в пробирках 1-12,
средняя оптическая плотность в пробирках со 100% гемолизом, средняя оптическая плотность в контролях с 0% гемолизом.
